熒光定量PCR試劑盒在實驗關鍵步驟及注意事項

　　以下是熒光定量PCR(qPCR)試劑盒實驗的關鍵步驟及注意事項，天津本生結合操作規(guī)范與常見問題解決方案：

　　一、實驗前準備?

　　試劑與耗材?

　　使用無RNase/DNase的槍頭、EP管，避免RNA降解?。

　　試劑盒組分需提前平衡至室溫(20-25℃)，避免溫度波動影響反應效率?。

　　樣本處理?

　　RNA提取后需檢測濃度(A260/A280=1.8-2.0)及完整性(RIN≥7)?。

　　反轉錄cDNA時需設置無模板對照(NTC)和基因組DNA去除步驟?。

　　二、反應體系配置?

　　加樣順序?

　　推薦先配制主反應混合液(含酶、dNTPs、緩沖液等)，再分裝至各孔，最后加入模板?。

　　加樣誤差需<5%，避免交叉污染(如使用排槍或自動化工作站)?。

　　關鍵參數(shù)?

　　引物終濃度通常為0.1-1μM，需通過梯度實驗優(yōu)化?。

　　SYBR Green法需設置熔解曲線分析引物二聚體?。

　　三、儀器操作?

　　程序設置?

　　三步法程序：95℃預變性10分鐘→(95℃ 15秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒)×40循環(huán)?。

　　熒光信號采集需設置在退火/延伸階段(SYBR Green法)或探針結合階段(TaqMan法)?。

　　數(shù)據(jù)采集?

　　基線范圍設為3-15循環(huán)，閾值設為指數(shù)期熒光信號10倍標準差?。

　　四、常見問題與解決?

　　問題? ?可能原因? ?解決方案?

　　擴增曲線斷裂 氣泡干擾或模板濃度過高 瞬離去除氣泡，稀釋模板?

　　無擴增信號 引物降解或反應條件不匹配 重新設計引物，優(yōu)化退火溫度?

　　熔解曲線多峰 引物二聚體或非特異擴增 重新設計引物或提高退火溫度?

　　注：不同品牌試劑盒參數(shù)可能差異較大，建議以實際說明書為準?。

　　注：僅供科研使用，以上資料供參考，如需具體產(chǎn)品說明請咨詢技術老師或品牌供應商。

　　熒光定量PCR試劑盒 天津本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標，本生，您信任的合作伙伴!本生試劑盒