干貨分享—細胞培養(yǎng)常見問題、可能原因及解決方法

　　問題1：培養(yǎng)液pH 值變化太快

　　可能原因：

　　(1)CO2 張力不對

　　(2)培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊

　　(3)NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足

　　(4)培養(yǎng)液中鹽濃度不正確

　　(5)細菌、酵母或真菌污染

　　建議解決方法：

　　(1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5% 到10%。

　　(2)松開瓶蓋1/4 圈。

　　(3)改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。

　　(4)在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。

　　(5)丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

　　問題2：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變

　　可能原因：

　　(1)洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來

　　(2)冰凍保存培養(yǎng)液

　　建議解決方法：

　　(1)用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。

　　(2)將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。

　　問題3：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時pH 發(fā)生變化

　　可能原因：

　　細菌或真菌污染

　　建議解決方法

　　丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

　　問題4：培養(yǎng)細胞不貼壁

　　可能原因：

　　(1)胰蛋白酶消化過度

　　(2)支原體污染

　　(3)培養(yǎng)瓶瓶底不干凈

　　(4)培養(yǎng)液pH值過堿(NaHCO3分解)

　　(5)消化液或培養(yǎng)液配制錯誤、過期儲存、儲存不當(dāng)

　　(6)細胞老化(如傳代前細胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性)

　　(7)接種細胞起始濃度太低或太高

　　建議解決方法：

　　(1)縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。

　　(2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　(3)注意刷洗，或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶

　　(4)使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2(將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可)

　　(5)重新配置消化液或培養(yǎng)液

　　(6)啟用新的保種細胞

　　(7)調(diào)節(jié)最佳接種細胞濃度

　　問題5：懸浮細胞成簇

　　可能原因：

　　(1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子

　　(2)支原體污染

　　(3)蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋

　　(4)DNA污染

　　建議解決方法：

　　(1)用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液。

　　(2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　(3)用DNase I 處理細胞。

　　問題6：原代細胞培養(yǎng)物污染

　　可能原因：

　　原代培養(yǎng)組織在進入培養(yǎng)前已污染

　　建議解決方法：

　　培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。

　　問題7：培養(yǎng)細胞生長減慢

　　可能原因：

　　(1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清

　　(2)培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。

　　(3)培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染

　　(4)試劑保存不當(dāng)

　　(5)接種細胞起始濃度太低

　　(6)細胞已老化

　　(7)支原體污染

　　建議解決方法：

　　(1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。讓細胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。

　　(2)換入新鮮配制培養(yǎng)液，或補加谷氨酰胺及生長因子。

　　(3)用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。

　　(4)血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2 周內(nèi)用完。

　　(5)增加接種細胞起始濃度。

　　(6)換用新的保種細胞。

　　(7)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　問題8：培養(yǎng)細胞死亡

　　可能原因：

　　(1)培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2

　　(2)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大

　　(3)細胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷

　　(4)培養(yǎng)液滲透壓不正確

　　(5)培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積

　　(6)更多原因參考問題4和問題7

　　建議解決方法：

　　(1)檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2

　　(2)檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度

　　(3)取新的保存細胞種

　　(4)檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

　　(5)換入新鮮培養(yǎng)液

　　(6)更多解決方法參考問題4和問題7

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